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抗体五大支柱验证

2022-11-10
浏览次数: 177

GeneTex 是由科学家为科学研究而创立,我们了解研究人员期望并要求产品保真度,考虑到这一点,我们将越来越多的敲除/敲弱 (KO/KD) 验证测试纳入我们的质量保证 (QA) 标准,KO/KD 测试是我们提升“五大支柱验证”计划的主要方式,目的是向我们的客户证明他们购买的 GeneTex 试剂值得他们信赖。


在特异性和性能可变性方面,人们越来越不信任市售抗体,因此,科研界要求抗体供应商加大力度,更彻底地验证他们的产品,解决此问题的一种方法是通过敲除或敲弱靶蛋白。


GeneTex通过利用 CRISPR/Cas9 和 shRNA 生成的细胞裂解物进行蛋白质印迹分析,继续为科研界提供最高质量和最严格验证的抗体,迄今为止,我们已经评估了我们的大部分特色产品,并将继续在我们的整个抗体目录中扩大这些努力。


2016 年 Nature 子刊建议的 5 种抗体验证方式,即是挑选抗体的金标准。


五大验证包含基因敲除敲弱验证、比较抗体验证、免疫捕获与质谱分析、生物特性与正交策略、蛋白过表达策略等验证方式,说明如下:


一 基因敲除敲弱验证

抗体五大支柱验证

利用CRISPR/Cas9或RNAi等技术,将目标基因敲除或敲弱以验证抗体对蛋白质表现量变化的信号反馈。

抗体五大支柱验证

敲除(Knockout)使用 CRISPR/Cas9 将目标基因从整个基因组里去除,使目标蛋白不表达,收取此 Knockout 细胞裂解液作为对照组,可确认抗体专一性。

抗体五大支柱验证

敲弱(Knockdown)使用 siRNA 将目标基因静默,基因还在,但蛋白表达量降低甚至不表达。收取此 Knockdown 细胞裂解液作为对照组,可确认抗体专一性。


基因敲除敲弱验证就是取有表达蛋白的细胞裂解液,跟使用基因技术去除或减少蛋白的裂解液做比较,如果抗体专一性辨识蛋白,应该会出现一个样本有强条带,另一个样本弱(无)条带,如抗体无专一性则条带无变化。


范例: Vimentin antibody [HL1506] (GTX636980)

抗体五大支柱验证


二 比较抗体验证

抗体五大支柱验证

使用两种可识别目标蛋白表面不同抗原表位的独立抗体,并通过对比或定量分析确定特异性。相同靶标、相同处理的样品,理论上抗体辨识的条带位置应该相同。如不相同,可能有其一抗体辨识错误蛋白或是其他原因;另外也可以通过比较找到更高敏的抗体。


范例: ERK1 (phospho Thr202/Tyr204) + ERK2 (phospho Thr185/Tyr187) antibody [HL173] (GTX635617)

抗体五大支柱验证


三 免疫捕获及质谱分析

抗体五大支柱验证

利用IP/MS分析可直接定序与抗体直接发生相互作用的目标蛋白以及其所形成的蛋白质复合物,将免疫捕获的目标蛋白进行质谱分析,可确认捕获的蛋白身份是否为目标蛋白,以此确认抗体是否辨识到对的蛋白。


范例: PARP antibody [N2C1], Internal (GTX112864)


GTX112864 PARP 抗体通过免疫捕获及质谱分析验证(PMID:30377371),可进行 WB、ICC/IF、IHC-P、IP、ChIP assay 等多种应用,GeneTex的“PARP antibody [N2C1], Internal”通过了五项“抗体验证支柱”的所有测试,证实其具高质量,高性价,与高特异性的产品优势。此外,它已在多篇文献中被引用,在不同物种上均能进行DNA修复,基因组稳定性和细胞凋亡方面的研究。

抗体五大支柱验证

抗体五大支柱验证

抗体五大支柱验证

抗体五大支柱验证


四 生物特性与正交策略

抗体五大支柱验证

生物特性与正交策略是指利用目标蛋白质本身的生物特性作为基础进行定性与定量验证,或使用非抗体依赖方法(例如RNA表达量),检测基于抗体与生物特性或非抗体定量间的相关性,来验证抗体的专一性,包含:

1. 使用加药测试;

2. 以特殊条件处理细胞;

3. 使用已知具有蛋白高低表达量的样本作为阳性与阴性对照组;

4. 细胞定位;

5. 组织专一性。

6. 范例: PD-L1 antibody [HL1041] (GTX635975)

抗体五大支柱验证


五 目标蛋白过表达

抗体五大支柱验证

利用在细胞中过表达目标蛋白,并收取细胞裂解液后进行 WB 分析,理论上蛋白量增多,抗体辨识后的信号也会增强,因此可确认抗体是否特异性辨认正确蛋白,过表达目标蛋白可作为抗体验证的正控制组。


范例: PAX3 antibody [HL160] (GTX635463)

抗体五大支柱验证


问题:

Q:五项验证要同时通过吗?

A:五项验证要同时通过是非常困难的,主要受限于技术与材料,大部分的抗体验证仅能通过 1~2 项的验证,能同时通过 5 项验证可说是少之又少,GeneTex的GTX109669 Calnexin抗体就是少数的例子之一,该抗体通过 5 项验证方法,并且全面验证 WB、ICC/IF、IHC-P、IP,是目前唯一一个能同时通过 5 种验证的Calnexin抗体。

抗体五大支柱验证

抗体五大支柱验证

抗体五大支柱验证

抗体五大支柱验证

注:【免疫捕获及质谱分析】验证数据请参考 Nat Methods 期刊(PMID:30377371)


GeneTex还有 GTX628887 EGFR 抗体和GTX629744 Vimentin抗体、GTX107678 NFkB p65抗体、GTX112864、GTX112839 PARP 抗体都是少数同时通过五种验证的例子。

货号

产品名称

应用

物种

GTX109669

Calnexin antibody [C3], C-term

WB, ICC/IF, IHC-P, IP

Hu, Ms,
Rat, Sheep

GTX628887

EGFR antibody [GT133]

WB, ICC/IF, IHC-P, IP

Hu

GTX629744

Vimentin antibody [GT812]

WB, ICC/IF, IHC-P, IHC-Fr, FACS, IP, ELISA, Sandwich ELISA

Hu, Ms, Rat

GTX107678

NFkB p65 antibody

WB, ICC/IF, IHC-P, IP, EMSA

Hu, Ms, Rat

GTX112864

PARP antibody [N2C1], Internal

WB, ICC/IF, IHC-P, IP, ChIP assay

Hu, Ms, Rat

GTX112839

PARP antibody [N1N2], N-term

WB, ICC/IF, IHC-P, IP, ChIP assay

Hu, Rat


挑选通过基因敲除敲弱、比较抗体、免疫捕获及质谱分析、生物特性与正交策略和蛋白过表达五大支柱验证的抗体,有助于实验不走弯路,降低失败率,更快完成实验。



更多详细信息,请咨询GeneTex独家代理商-欣博盛生物


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