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大鼠活体注射建模DAB操作步骤

2021-11-24
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该实验操作指南是将1 型小鼠PFFs (SPR-324) 或1 型人PFFs (SPR-322) 注射到大鼠脑中来产生alpha突触核蛋白病理特征。小鼠PFFs显示出了更强的聚集效果。

使用的动物: 雌性SD (Sprague Dawley) 大鼠

2 uL PFFs 或者单体 (阴性对照) 通过以下两个脑顶叶区的位置注射:

•AP + 1.6, ML + 2.4, DV – 4.2

•AP – 1.4, ML + 0.2, DV – 2.8

30天后, 用生理盐水灌注大鼠然后在大鼠脑冠状平面切开,将中脑与前脑分开。之后两部分都用4% PFA 固定 48 小时.


DAB 操作步骤

材料

•1X TBS (含有和不含有 TX-100的)

•30% H2O2

•柠檬酸缓冲液

•驴血清 (保存在 -20℃; 冻融稳定的)

•一抗: pSYN EP1536Y (Abcam; ab51253)

•二抗: 生物素-SP (long spacer) AffiniPure 驴抗兔 IgG (H+L) (Jackson Immuno; 货号: 711-065-152)

•ABC 试剂 (Vector; 货号: PK-7100)

•DAB 试剂 (Vector; 货号: SK-4100)

•孔板 (规格取决于要染色的区域数量)

•漆刷

•玻璃钩

•漂白剂

•ddH20

•BD Luer-lock 注射器 10 mL

•过滤器 0.22 uM 孔径 (Fisher 货号. SLMP025SS)

•100% EtOH

•Histoclear (用于清理组织)

•显微镜载玻片和盖玻片

•Permount (封片剂)

 

第一天:    (猝灭, 抗原修复, 阻断, 一抗)

-用 1X TBS (震荡, 室温)冲洗切片 5 次以除去冷冻保护剂。

-把切片放到 0.6% H2O2 的 TBS 中,覆盖好,置于操作台20分钟。

*该步骤不要用MESH WELLS*

用 _______ mL TBS, _______ uL 30% H2O2

-用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片3次。

-做抗原修复时, 提前在水浴中预热柠檬酸缓冲液至少15~30分钟。在柠檬酸缓冲液中培养切片一小时,将温度设置为37℃,不要震荡 。

-用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片3次。

-阻断时, 将切片置于 5% 常规驴血清和0.25% Triton-100的TBS 中阻断 1 小时,冷室、震荡。

*注意: 可以使用含有Triton的TBS阻断液 (1 L TBS, 2.5 mL TX-100), 之后只需要向阻断液中加入驴血清来阻断。*

用 _______ mL TBS,

_______ uL 驴血清, _______ uL 10% TX-100

-用 1X TBS (震荡, 室温) 冲洗切片3次。

-用含 5% 驴血清的 TBS制备一抗溶液,稀释度为1:5000。用锡纸包好切片,和抗体一起在冷室中震荡培养过夜。

用 _______ mL TBS,

_______  uL 驴血清, _______ uL pSYN EP1536Y


第二天:    (二抗, ABC 扩大信号, DAB 染色)

-用 1X TBST (震荡,室温) 冲洗切片3次. 余下的步骤中,需要一直将切片保留在锡纸里,即使是冲洗的步骤。

-用含 5% 驴血清的 TBS 制备二抗溶液,稀释度为1:500。在冷室中培锡纸养盖好的切片2小时,震荡。

用 ______mL TBS,

 ______ uL 驴血清, _______ uL 生物素标记的驴抗兔 IgG

-用 1X TBST (震荡,室温) 冲洗切片3次。

-用 ABC 试剂培养切片 30 分钟 (震荡, 冷室)。

-用 1X TBS 冲洗切片 3 次 (震荡,室温)。

-用 falcon 离心管和 ddH2O制备 DAB 溶液,每 5 mL H2O 加入如下溶液然后涡旋混合:

2 滴缓冲溶液

4 滴 DAB 溶液

2 滴双氧水溶液

*注意: 所有接触过DAB的器具只能用来操作DAB。我们还在通风橱内准备了一个DAB专用的废液缸。使用玻璃钩来处理DAB溶液中的切片而不能用漆刷,并且操作后要用漂白剂冲洗玻璃钩。盛装过DAB的器皿都需要用漂白剂冲洗并且处理到生物性危害箱中。*

-用注射器过滤到新的6孔板中。每一个需要染色的脑切片都用一个新的DAB孔。

-在DAB中培养每个切片直到变为浅棕色 (2-3 分钟就足够; 时间太长可能会造成背景染色太多)

-用 ddH2O 冲洗 3 次

-在 1X TBS 中封片,然后在切片柜中干燥过夜。


第三天:    (脱水和盖玻片)

*注意: 在开始脱水步骤之前,确保浸片用的玻璃皿里有足够的液体可以盖过切片上的所有组织。*

-按照如下顺序和时间脱水切片:

1. 30 秒 ddH20

2. 3 分钟 70% EtOH

3. 3 分钟 95% EtOH

4. 3 分钟 95% EtOH

5. 3 分钟 100% EtOH

6. 3 分钟 100% EtOH

*置于振荡器*

7. 5 分钟 Histoclear

8. 5 分钟 Histoclear

9. 5 分钟 Histoclear

-将切片从切片篮从取出,一次一片,置于吸水纸上。

-加封片剂时,取一个P1000 移液器和吸头,将吸头尖剪掉,容量设到400到500 μL.

-连续滴几滴封片剂 Permount 到切片的中间,倾斜切片使封片剂完全覆盖切片。

-用棉棒的木头一端赶出切片中的气泡。

-将切片放在吸水纸上,置于操作台上过夜晾干。

*注意: ~24 小时之后, 多余的Permount 封片剂应该用Histoclear移除*


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