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ELISA实验操作常见问题及解决方案

2022-12-13
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当我们科研小伙伴们在进行科研实验的时候,对于实验上的一些操作,肯定多多少少会存在一些实验操作上的问题的,本文就总结了一些ELISA实验操作的常见问题,及给出解决方案。当然,如果这些内容未能帮助到您,还请及时与我们联系哦。


一、为什么所有试剂和检测样本要平衡至室温后再进行加样操作?

温度是ELISA结合反应的重要影响因素。为了使所有样本在一致的温度下反应,实验前务必将所有试剂平衡至室温,包括检测样本。避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA检测结果的不准确。


二、如何获得良好线性的标准曲线?

按照推荐方式保存标准品;溶解标准品之前需短暂离心,彻底收集粉末;确保标准品完全溶解和混匀(大约10min),然后再进行后续的系列稀释步骤,确保每一步都充分混匀且精确移液;显色的恰当终止;选择合适的数学拟合方程绘制标准曲线。


三、ELISA实验为什么必须设置复孔?

为获得更准确的实验结果,强烈建议标准品及样本进行复孔检测。

因为复孔检测可以:

★计算平均值,确保实验结果更准确;

★解决实验中误操作造成的跳孔现象;

★计算CV值,对实验的操作和试剂盒的精密度进行评估。


四、为什么实验过程中孵育、洗涤需要振荡?如何振荡?

振荡孵育使反应更充分,振荡洗涤使背景更干净。建议使用酶标专用96孔微孔板振荡器。

孵育过程振荡,可以加快、加强抗原抗体分子间的相互碰撞接触,使得反应过程更加完全,OD值通常会比未振荡孵育的结果要高;洗涤过程振荡,可以使洗板更干净,在很大程度上 能降低背景值,同时可以提高试剂盒检测的灵敏度。


五、何时终止ELISA反应?

ELISA实验最终需要酶催化底物显色反应来完成,在最佳时间终止反应是ELISA实验成功的重要因素。在HRP-TMB酶促反应系统中,S5出现淡蓝色,S1 – S3有明显的阶梯型蓝色,便需要终止反应;或者根据最高浓度标准品孔在620nm的OD值来决定,OD620=0.9-0.95之间时即可终止。


六、为什么酶标仪读数时必须选用双波长?

首先,酶标仪使用前务必预热10-15min,使测读结果更稳定。其次,ELISA实验采用双波长测定吸光度,可以排除单波长检测时的测定干扰(标本的浓度,干扰色等)。一般采用最大波长作为参照波长,在参照波长下,检测物的吸光值最小,检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收;因此,双波长测定,可最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差,以保证实验数据的准确度。


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