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为什么我们建议ELISA实验要做预实验?

2022-09-06
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说到预实验,相信做科研的你们一定不陌生。预实验是开展正式实验前必不可少的环节之一,主要用于摸索合适的实验条件及确定实验的可行性。而使用商品化的ELISA试剂盒,实验条件和实验流程都已确定,为什么还要浪费时间且耗费试剂去做预实验呢?


下面我们就来聊聊ELISA实验中的预实验,为什么要去做预实验:


1. 熟悉实验操作 不同的商业化的试剂盒产品,对于操作细节都会有所差异。比如试剂盒的温育温度,有些是4度,有些是常温,还有些需要在37度恒温条件下反应。使用商业化的试剂盒,需要严格按照试剂盒的说明书要求完成实验,不要因为操作步骤与平时的实验习惯不同,就随意改变说明书中的操作,导致不理想的实验结果。在正式实验之前,熟悉下整体实验操作流程是有必要的。


2. 优化实验方案 做预实验时,可以记录下使用过程中出现的疑问,得到结果后,进行总结分析,并可联系试剂盒厂家的技术人员给出建议,确保正式实验有序进行。 


3. 预测样本量,确定样本最适稀释倍数 商业化的试剂盒在出厂验证时,会测定不同种类的样本,确定试剂盒测样的有效性。通常,对于成分稳定的血清血浆样本,可根据说明书中推荐的稀释倍数完成实验。另外,由于试剂盒厂家获取样本的渠道有限,一般只能验证正常个体的血清血浆样本,而某些靶标物在疾病、服用药物等生理状态下,表达量也会不同,这种情况下,也需要通过预试验确定样本最适稀释倍数后,再进行大量样本的测定。 不同于血清血浆,有些样本存在诸多影响靶标物含量的干扰因素,如:组织样本的干扰因素包括:组织类型、提取方式、刺激处理方式等;细胞样本的干扰因素包括:细胞状态、细胞数量、采样时间、刺激处理方式等;尿液&唾液&乳汁样本的干扰因素包括:饮水量、采样时间、采样方式等。这些干扰因素均会直接影响样本中靶标物的浓度,建议实验前先通过预试验,预测样本中靶标物的含量,确定样本最适稀释倍数,再进行正式实验。还有一些特殊样本,如:**灌洗液、**、龈沟液,试剂盒生产厂家不易获取,也不会用于试剂盒的验证,且相关的研究报道不多,这类样本也有必要先做预试验,摸索合适的样本稀释倍数,再开展正式实验。 显然,预试验不仅不会造成试剂和样本的浪费,用少量的样本和试剂完成预试验确保正式实验大量样本的测定能够有序进行,经济且省时省力。 


如何设计ELISA预实验?


1. 实验样本的选择 预实验一般通过测定少数有代表性的样本来确定正式实验方案。如何选择有代表性的样本开展预实验呢?通常,测定的样本会分为不同的组别,不同组别的样本由于前期处理or刺激后,靶标物的表达量会产生变化,建议从各组样本中随机选择1-2例样本。如果正式实验测定的样本数量多,分配到预实验的试剂量有限,那么至少选择两例样品,建议选用1例为理论上靶标物含量最低组的样品,另1例为理论上靶标物含量最高组的样品。


2. 最适稀释倍数的确定 将样本梯度稀释,可根据样本中靶标物的浓度,选择2倍、5倍或10倍梯度稀释,同时测定标准品。标准品的制备需按照试剂盒说明书的要求,试剂量充足可以选择一条完整的标曲,试剂量有限也可以选择部分浓度点(如空白孔、最低浓度孔、中间浓度孔以及最高浓度孔)。将测定的不同稀释浓度的样本测定的O.D.值与梯度浓度标准品O.D.值进行对比,最佳稀释倍数为此倍数稀释后全部/绝大多数样本O.D.值能够位于标准曲线中间浓度孔对应的O.D.值,即标准曲线的最佳拟合区域。需要注意的是在做预实验时,一定要设置标曲,不设置标曲,就如同在丈量时没有尺一样,无法通过比较确定最适稀释倍数。


3. 显色时间的确定 显色是ELISA实验中最后一步温育反应,固定在酶标板上的酶催化无色底物生成有色产物。由于ELISA实验会受到环境差异及实验操作差异的影响,商业化的ELISA试剂盒通常不会推荐固定的显色时间,而是建议实验操作人员根据显色情况判断合适的显色反应时间。加入底物后可定时观察反应孔的颜色变化(如每隔5分钟观察一次),当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔梯度不明显时,即可终止。通过预实验熟悉操作的同时,也能确定合适的显色时间。


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