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免疫组化故障排除指南(解决方案)

2022-08-23
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很多科研的小伙伴在做免疫组化实验时,可能会遇到一些奇奇怪怪的问题,本篇小欣整理了免疫组化故障排除指南,大家可以根据下列的免疫組化故障排除指南来快速找出问题原因,改善您的实验步骤和解决方案。


首先可以从下面几个情况中找到您的免疫荧光染色的问题所在:


一、染色较弱或无染色


可能存在的问题及解决方案:


一抗量不够:

增加抗体浓度

延长孵育时间


一抗二抗不兼容:

二抗应该是抗一抗宿主的。例如,如果一抗是小鼠来源的,那就需要用抗小鼠的二抗

亚型需要兼容


待测组织干透:

在整个染色过程中都需要使样品完全被覆盖于溶液中。


细胞没有通透:

用甲醇或者丙酮固定可以通透细胞

如果使用甲醛固定,用0.2% Triton X-100通透细胞


脱蜡不充分:

加长切片脱蜡时间

确保使用新鲜配制的二甲苯


一抗不适用:

确保抗体被验证过适用于对应类型的IHC, 福尔马林固定, 石蜡包埋, 新鲜冻存切片等等。

• 使用WB先检测抗体,确保抗体没有变质。


组织过度固定:

减少固定的时间

做抗原修复以显现抗原表位


孵育时间太短:

增加一抗和样品孵育的时间


切片储存问题:

样品染色后应该尽快观察,否则信号会随时间减弱。如需要的话,将切片保存在 4⁰C 黑暗处。


抗体储存问题:

反复冻融是对抗体不利的,可引起降解. 最好是在收到产品时将其分成多个小份来保存。

抗体没有按照建议的方式保存. 如果是这样的话可能需要重新购买一支。

如果二抗没有在黑暗处保存 (使用免疫荧光时), 应更换一支新的二抗。


蛋白没有在检测的组织中出现:

做一个阳性对照

如果目标蛋白显现但是信号不强, 增加一个扩大信号步骤


二、高背景染色


可能存在的问题及解决方案:


脱蜡不充分:

加长切片脱蜡时间

确保使用新制的二甲苯


内源的过氧化物酶活性:

如果使用的是HRP检测系统,在进行染色步骤前用3% H2O2 降低内源过氧化物酶活性


内源的生物素:

如果使用的是生物素检测系统,而样品中内源生物素水平又很高 (例如. 肾脏,肝脏,胰脏),那么需要先使用抗生物素蛋白孵育样品来封闭内源生物素,再进行正常的封闭步骤,然后在一抗孵育前再用生物素封闭。


抗体浓度太高:

进一步稀释一抗/二抗


非特异性结合:

做一个没有一抗的二抗空白对照.  如果有染色,说明二抗有非特异性结合,更换一种二抗,或者使用标记一抗


封闭不充分:

增加封闭孵育时间或考虑更换封闭液。


信号放大过度:

减少信号放大孵育时间,稀释二抗


洗涤不充分:

步骤之间的适当洗涤非常重要. 确保遵循说明说上的洗涤步骤


组织切片太厚:

考虑使用更薄的切片,因为过厚的切片超过了共焦平面的部分会造成过度的背景染色


三、非特异性染色


抗体浓度过高:

降低抗体的浓度和孵育时间


一抗宿主与要染色的组织来源是同一物种 (例. 小鼠抗小鼠的一抗):

• 尝试使用来自不同物种的一抗。或者尝试用二抗宿主的血清来阻断内源的IgG 。或者用 1% Triton 孵育切片以清理组织。或者使用 TBS-Tween 20作为洗涤液而不是用 PBS-Tween 20。


如以上内容未能解决您的需求,可联系我们欣博盛生物相关技术同事,帮您解疑答惑。

 

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