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ELISA实验成功的八个小建议整理

2022-05-13
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酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种基于多孔板的技术,用于确定生物样品中的抗体、抗原或其他蛋白质的浓度,使用发色、荧光或发光的读数。其基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合,此种结合不会改变抗体的免疫学特性,也不影响酶的生物学活性。


自1971年开发以来,它已成为许多诊断和生物医学研究实验室的主力军,在一系列应用中表现出特异性、灵敏度和可重复性。常见的例子包括各种传染病的检测和妊娠试验。


作为检验科常用的免疫学检测方法之一,其操作简单,无须特殊设备,使其在各级医院都有应用。但是,如果实验中操作不规范,可能会造成假阴性或假阳性。因此,了解影响实验结果的关键因素对实验是否成功是非常重要的。


1、选择正确的检测方法


根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型:一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA,即我们通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA,称为斑点ELISA(Dot-ELISA);再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA,称为布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中,又根据其性质不同分为直接法、间接法、夹心法、竞争法等。


作为医学和食品工业的诊断、监测和质量控制工具。酶联免疫吸附试验的检测目标可以是抗原(例如,旨在检测病毒的存在)或可以是抗体(例如,旨在检测对抗原的免疫反应)。


为简单起见,下面的例子说明了抗原检测,然而同样的原理也适用于抗体检测。


ELISA实验成功的八个小建议整理


2.提前规划


提前规划可以帮助工作流程有效运行,并减少错误和重测的可能性;因此,有必要在工作流程开始前彻底规划工作流程的所有组成部分。流程图和检测设计是重要的规划考虑因素。需要确定的因素包括:待测样品的数量、复测次数和所需的试剂平板/试剂盒的数量。


3.样品处理和稀释


试剂和样品处理不当或储存不正确会影响下游分析,因为不同的缓冲剂和试剂会有不同的储存要求。例如,有些必须储存在冰箱里,有些在室温下,有些用感光罩(如铝箔)。


如果有计划在未来的实验中使用相同的样品,那么应该把它们放入等分试样中,需要时再取出来。这将避免多次冷冻/解冻循环,保持准确的结果。当样品准备使用时,应在冰上解冻(或根据方案)。


4.确保一致性和准确性


获得一致和准确结果的方法之一是确保实验台被适当地设置,使所有的组件和仪器都触手可及。使用经过校准的精密移液器也将限制移液过程中的任何不一致。


运行内精密度是指各孔之间的误差。如前所述,加入重复样本对识别错误和异常情况很重要。变异系数(CV)是一个描述群体内变异性的比率,与观察值的绝对值无关。当解释ELISA的数据时,%CV对于识别样品复制中的任何不一致是很有用的。这表现在测定后的光密度(OD)值之间的变化。总之,%CV越低,结果越精确。


检测间的精确性是指板间或检测间的重复性,如在不同的日子完成的检测。尽管商业化的ELISA试剂盒有测定间质量控制,但科学家们必须保留一个详细的笔记本,记录在方案中任何时候的变化,以便其他研究人员能够以同样的方式完成同样的实验,获得同样的结果。这也使得检测能够随着时间的推移进行监测,以确定任何系统性问题或检测性能的下降。


5.避免污染


污染会在ELISA数据的下游分析中造成许多问题,如孔与孔之间的高差异、高背景值和弱或低信号强度。有几种方法可以防止污染:


5.1 在一个干净的环境中工作;

5.2 通过去离子或蒸馏对所有的水进行消毒;

5.3 每次转移时使用新的和干净的试剂;

5.4 在两个样品之间使用新的移液器吸头;

5.5 准备和应用样品时要小心,避免溅到或交叉污染;

5.6 如果使用自动化,确保系统被清洁,试剂供应经常更新;

5.7 只去除试剂需要的部分,避免将其倒回库存瓶中,因为这可能会引入污染物。


6.正确的洗板技术


正确的洗涤和冲洗方案尤其重要。在下游分析过程中,不充分、不一致和/或过度清洗会造成问题。有许多洗板的方法,包括使用自动洗板机、手动分流器或洗瓶。当手动吸出孔中的液体时,要注意不要碰到孔的底部--吸管的尖端应该放在孔的一侧。为了减少背景信号,清洗量需要足够大,以去除孔中未结合的样品和试剂。然而,过度洗涤会减少目标信号。


确保所有的孔都被平均清洗,以避免在整个检测板上引入信号变化。要做到这一点,如果是手工清洗,请检查移液器吸头是否固定好,如果使用自动洗板机,所有分配和吸液的喷头必须没有堵塞。你可以在空板上测试它们,以检查它们是否同样工作。


7.数据归一化


准确的数据分析是ELISA工作流程中非常重要的一步,它解决了测定间的变异性问题,这可能受到许多因素的影响,如温度和发育。为了限制这些因素对检测结果的影响,应在实验之间通过比较每个板上的标准品来进行归一化。


8.保持在动态范围内


至关重要的是,检测样品要保持在板式读数器的动态范围内,否则结果将不具代表性,仪器的动态范围可以在机器手册中找到。在开发检测方法和确定样品稀释度时,最高和最低的阳性样品都应落在仪器的动态范围内。标准品通常与ELISA试剂盒一起提供;然而,这些也可以独立采购。


希望ELISA实验人员在操作过程中遵循上面的提示,以确保实验产生准确和可靠的结果。


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