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Western blot常用封闭液及注意事项

2022-04-27
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通常我们在做Western blot实验中,会用到固相载体(如NC膜,PVDF膜),在这些固相载体表面有很多洞洞,通过电转,胶上的蛋白被转移到膜上,蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面的很多洞洞里面,但是蛋白并不是连续的,而有很多空隙,抗体也是蛋白,也会被吸附在空的洞里,这样就会有很多非特异性的信号。


封闭液中的蛋白可以与固相载体表面的空白位置结合,同样以机械填补(堆积)和吸附覆盖的方式结合在膜上,因为有“填补”和覆盖“蛋白结合位点以避免一抗的非特异性结合,所以有”封闭“的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够狠牢固的结合在空白位置上,这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上,而只会跟特异性蛋白结合。


封闭液应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白,不结合靶蛋白表位,也不与抗体或检测试剂有交叉反应。


常见的封闭液:


1.BSA  BSA是最常用的封闭液,成分单一适用于大多数情况。若免疫原是偶联BSA的,BSA有很强的免疫原性,会导致产生很多针对BSA的抗体,为避免交叉反应,不能用BSA,脱脂奶粉封闭,可以选用酪蛋白或无蛋白的封闭液。


2.血清  封闭血清的原理主要有两点,第一是待测样本有些与蛋白非特异性结合的物质,从而导致背景过高,因此可以用BSA或血清封闭掉这部分分特异性的结合,从这点看,BSA和血清没有明显区别。第二待测样品中可能会有Fc受体,可以和抗体恒定区结合,与抗体特异性无关,封闭血清中有抗体,因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间的结合,BSA无法封闭Fc受体。


3.脱脂奶粉  脱脂奶粉最大的优点是价格便宜,但由于成分相对复杂,所以适用范围要狭窄一些。磷酸化抗体也许会导致背景增加,此外,因为自身含有生物素,不能用于生物素标记的抗体系统。脱脂奶粉种含有少量的生物素和碱性磷酸酶残留,在使用生物素-亲和素系统和碱性磷酸酶标记的二抗时,也会使得高背景或本底水平增高。


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