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Stressmarq推出新产品----β-淀粉样肽1-42相关产品

2022-04-06
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由于神经退行性疾病的复杂成因,目前临床上尚缺乏有效的治疗方案,甚至对疾病病理进程也未完全了解。在研究 AD 的过程中,最先引起科研学者们注意的相关蛋白是 β 淀粉样肽,其出现在 AD 患者的大脑斑块中,被认为是导致神经元变性甚至死亡的原因[2]。因此最初的药物和治疗方案都是针对该蛋白,但令人失望的是,这些新药研发全军覆没。于是国内外更多的研究重点又放在了 tau 蛋白上。


不过,随着越来越深入的研究,科研学者们发现 AD 可能不是单纯由某一个蛋白致病,而是两种蛋白同时出现问题共同导致的疾病进程[3]所以,科研学者决定重新对 β 淀粉样肽开展研究。


从结构和机制上来说,β 淀粉样肽简称 Aβ,是淀粉样肽前体蛋白(APP)的水解产物。APP 则是一种跨膜整合蛋白,存在于多种组织当中,尤其是在 AD 中有重要角色的神经元突触[4]。APP 蛋白水解之后释放 Aβ,而后聚集沉积,是淀粉样斑块的主要成分。Aβ 和 tau 蛋白以及 α 突触核蛋白都有类似的蛋白聚集机制,从单体到寡聚体再到原纤维,然后像种子一样诱导更多单体形成原纤维/聚集体。


从形式和特性上来说,Aβ 肽是单体,主要有两种形式 Aβ40  和 Aβ42,前者在正常老年人和 AD 患者脑中含量丰富,而后者主要存在于 AD 患者脑中[5]。Aβ42 非常不稳定且极其容易聚集,导致研究它的各种结构(单体、寡聚体、原纤维)非常困难[6]。由于 Aβ1-42 在水溶液中是无结构的,而非极性溶剂可以诱导 α 螺旋结构[7],所以目前市面上常用的是 HFIP(1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇,一种非极性溶剂)处理的 Aβ 肽,使之稳定于单体状态。当 HFIP 中水的含量增加时,α 螺旋开始变成 β 折叠[7],也就是聚集过程的开始,因此 Aβ 单体在运输和储藏过程中是干粉状态,需要防潮,避免水份的加入。


StressMarq 的 β 淀粉样肽 1-42(Aβ42)为合成肽,在干燥前用  HFIP 处理,从而可以分解前体原纤维并使肽单体化,一些文献中也使用该方法[8,9]。在 DMSO/dH2O 中重新悬浮后,当在 TEM、AFM 和具有抗 Aβ 抗体的蛋白质印迹下观察时,Aβ42 呈现为不含原纤维的单体肽。值得注意的是,与 Aβ42 寡聚体和原纤维相比,Aβ42 单体对原代大鼠皮层神经元没有毒性。


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图 1. 从左至右分别为 Aβ 单体(SPR-485),寡聚体(SPR-488)和原纤维(SPR-487)的电镜图。负染色透射电子显微镜图像在 80 Kv 下在碳涂层的 400 目铜网格上使用磷钨酸和乙酸双氧铀染色获得。比例尺 = 100 nm。


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图 2. 从左至右分别为 Aβ 单体(SPR-485),寡聚体(SPR-488)和原纤维(SPR-487)的原子力显微镜图。将 1.0 mg/mL 样品在 dH2O 中稀释至 0.1 mg/mL 置于新鲜切割的云母上,清洗、干燥并以轻敲模式进行原子力显微镜分析。上图为 2.5 x 2.5 µm x-y,z 范围为 10 nm。


淀粉样斑块的出现一直被认为是 AD 疾病的象征,但是它出现的数量和节奏都与 AD 疾病的进程不符,所以近年来,研究学者们发现推动疾病进程更多的可能是 Aβ 寡聚体和原纤维。制作寡聚体和原纤维的步骤在很多文献都有描述[8~10],以下图表为常用的处理方法:


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图 3. Aβ 寡聚体和原纤维制作流程[10]


StressMarq 的 Aβ42 寡聚体使用 Aβ 肽由特殊方法制得,F12 细胞培养基方法也在投入生产。Aβ42 寡聚体在电子显微镜(图 1)和原子力显微镜(图 2)下显示出明显的球状结构,而在 WB(图 4)中使用抗 Aβ 抗体显示出独特的二聚体/三聚体和寡聚体信号。同时 Aβ 寡聚体对原代大鼠皮质神经元有毒性(图 5)。Aβ42 原纤维使用 Aβ 肽由 HCl 方法制得,在电子显微镜(图 1)和原子力显微镜(图 2)下显示出明显的长链状结构,而在 WB(图 4)中使用抗 Aβ 抗体显示出独特的高分子量信号。同时 Aβ 原纤维对原代大鼠皮质神经元有毒性(图 5)


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图 4. 从左至右分别是 Aβ 单体(SPR-485),寡聚体(SPR-488)和原纤维(SPR-487)的 WB,抗体是抗 Aβ6E10 抗体。三种 Aβ 蛋白(160 pmol)在 4%~12% Bis-Tris SDS-PAGE 上跑胶后,在 0.02% v/v Tween-20 存在下转移到硝酸纤维素上,并用 1:1000 小鼠 6E10 一抗做 WB。在 TEM/AFM 下观察到的寡聚体显示出明显的二聚体/三聚体条带以及来自 ~37-75 kDa 的信号(中)。在 TEM/AFM 下观察到的原纤维显示出大于 100 kDa 的信号,并且在浓缩胶(右)中有明显的信号。


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图 5. Aβ 1-42 寡聚体(SPR-488)和原纤维(SPR-487)对原代大鼠皮层神经元显示出剂量依赖性毒性,但单体(SPR-485)没有毒性。大鼠原代皮层神经元用不同浓度的(A)单体、(B)寡聚体或(C)原纤维处理 14 天后的存活率,由 MAP2 阳性神经元量化并表示为对照的百分比(空白对照设为 100%)。原纤维和相应的载体对照先在 Bioruptor 超声破碎仪中进行超声处理。测试条件在与未处理的对照和载体对照相同的板中运行,由不含 Aβ 1-42 蛋白的缓冲液组成。数据表示为平均值 +/- s.e.m.(n = 6)。使用单向方差分析和 Dunnett 检验对数据进行全局分析;** p < 0.01 统计数据相比于对照;## p < 0.01, #### p < 0.0001 统计数据相比于载体对照。§ 代表未经处理的对照条件。


总的来说,StressMarq 的 Aβ 单体、寡聚体和原纤维都可以应用于 WB,以及体内和体外实验。StressMarq 的 Aβ 寡聚体在毒性方面有潜力成为更好的建模工具,更多数据或产品详情,可联系一级代理商-欣博盛生物


参考文献:

[1]. https://www.bjnews.com.cn/detail/160067807215569.html

[2]. Shankar, G.M. et al. Amyloid-b protein dimers isolated directly from Alzheimer’s brains impair synaptic plasticity and memory. Nat Med. 2008 Aug;14(8):837-42.

[3]. Eisenberg, D.S. and Sawaya, M.R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annu. Rev. Biochem. 2017. 86:69–95.

[4]. Chen, G.F. et al. Amyloid beta: structure, biology and structure-based therapeutic development. Acta Pharmacol Sin. 2017 Sep;38(9):1205-1235.

[5]. Qiao L, Sun Y,  Qu Z. Research situation of tau proteins and β-amyloid protein in the pathological process and autophagic mechanisms in Alzheimer′s disease. Chin J Diagnostics(Electronic Edition), 2019,7(2): 94-97.

[6]. LeVatte,M.A. et al. Preparation and characterization of a highly soluble Aβ1-42 peptide variant. Protein Expr Purif. 2019 Dec;164:105480.

[7]. Zhang-Haagen, B. et al. Monomeric Amyloid Beta Peptide in Hexafluoroisopropanol Detected by Small Angle Neutron Scattering. PLoS One. 2016; 11(2): e0150267.

[8]. Stine et al. In Vitro Characterization of Conditions for Amyloid-β Peptide Oligomerization and Fibrillogenesis.2003. JBC. 278(13):11612-22.

[9]. Chromy et al. Self-Assembly of Aβ1-42 into Globular Neurotoxins. 2003. Biochemistry. 42:12749-12760.

[10]. Dahlgren, K.N.. et al. Oligomeric and Fibrillar Species of Amyloid-β Peptides Differentially Affect Neuronal Viability. J Biol Chem. 2002 Aug 30;277(35):32046-53.


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