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外泌体(Exosome)及其五种常用纯化方式介绍

2022-02-23
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外泌体(Exosome)是发现于1986年,一种直径约30~150nm的双层膜囊泡状结构小体,可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生,广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。


外泌体携带大量特异性的蛋白质(如细胞因子、生长因子)以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质,在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程,与多种疾病的发生和进程密切相关。由于外泌体的特殊结构和功能,使得它具有潜在的应用价值,一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标,另一方面也可以作为治疗手段,未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。


外泌体的研究日益活跃并令人瞩目。但是,由于外泌体的纳米尺寸,同其它类型的胞外囊泡在理化和生化特征上部分重叠,以及自身在大小、组成和功能方面存在异质性,其分离纯化也面临挑战。下面小欣给大家从文献中总结出了目前几大主流外泌体纯化方法,供大家参考。


1、差速离心法(UC)

通过差速超速离心分离外来体通常包括一系列不同离心力和持续时间的离心循环,以根据外来体与样品中其他成分的密度和大小差异来分离外来体,是目前最常用的分析方法。


优势:降低了使用分离试剂造成的污染和成本;样本处理量大,产量高。

缺点:仪器成本投入高,笨重,运行时间长,耗人力,不便携;超速离心可能破坏外泌体而影响下游分析;经常存在杂蛋白和脂蛋白污染。


2、基于大小的分离技术

超滤离心法也是目前很常用的纯化方法之一,其采用不同膜大小和截留分子量(MWCO)的膜过滤器,使大于MWCO的颗粒留下,而小于MWCO的颗粒被丢弃,超滤法作为一种有效的浓缩方法经常与其他外泌体分离方法联合应用。


分子排阻层析(SEC)也常被报道用于外泌体制备,使用具有化学惰性和稳定性的多孔填料,采用非吸附的层析方法,按照不同大小分子流经的路径长短不同来进行样品分离。外泌体在填料的排阻极限之外,无法进入填料的孔隙中,而紧跟着外水体积最先排出;蛋白等其它杂质由于分子量小,可以进入填料孔隙中,经过较长的路径而晚出峰,由此分离。

优势:超滤:快速,不需要特殊仪器,便携。将RNA提取液流经膜可直接用于RNA抽提。SEC:较高纯度外泌体;通常在重力流下操作从而保留了外泌体的完整性和生物活性;可重复性好;中度样本处理量。


缺点:超滤:仪器成本低,中等纯度;剪切力可引起外泌体损伤;有可能造成聚集和囊泡陷入膜孔中,或外泌体吸附在膜上而损失。SEC:仪器成本中等,需要专用的设备;不易放大,运行时间长。


3、外泌体沉淀(PEG-base)

聚乙二醇(PEG),它在水中具有超溶性,可以“束缚”水分子,迫使较难溶的成分,如EV、外泌体、蛋白质和其它较难溶的成分从溶液中分离出来。通常是4℃用PEG孵育样品过夜,随后通过低速离心或过滤即可沉淀回收外泌体。

优势:容易操作,不需要特殊仪器;样本处理量大,具有可放大性。

缺点:缺乏选择性的分离机制,容易和非外泌体污染共沉淀,如其它胞外囊泡、蛋白聚集体、 高丰度蛋白等;运行时间长,需要在分离前先去除脂蛋白等亚细胞颗粒,在分离后去除聚合物材料。


4、免疫亲和捕获技术

免疫捕获过程需要使用微珠,通常约1μm,其带有铁核,通常被称为磁珠,这些磁珠表面包被有可识别外泌体表面标记物(如CD9、CD63和CD81)的捕获分子。捕获分子通常是抗体,但也可能是配体或纳米小体。磁珠可生产用于捕获一个表面标记,如CD63,或使用泛捕获方法捕获所有这三个表面标记。

优势:针对特定来源或亚群的外泌体分离是很好的选择;相比于其它分离方法,纯度要高出很多;利于外泌体的分型。

缺点:试剂成本高,需要预先确认好的外泌体标签(抗原);样本处理量低,只有带标签的外泌体被识别而产量低;仅适用于Cell-free样品;肿瘤的异质性妨碍了免疫识别,可能会造成假阴性;抗原表位可能被封闭或掩藏。


5、微流控技术

微尺度下,利用外泌体的生理和生化特性进行分离,如免疫亲和特性、大小和密度,结合新兴的声波纳滤、电磁和电泳等技术。微流控技术包括捕获微流控技术、过滤微流控技术、磁分离微流控技术、声学分离微流控技术和介电泳微流控技术等。

优势:快速、低成本、高度便携、容易实现自动化,可将外泌体分离和后续检测进行集成。

缺点:缺乏标准化和大规模的临床样本测试,缺少方法验证,低/中等程度的样本处理量。


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