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Stressmarq新产品---α 突触核蛋白寡聚体

2021-11-19
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帕金森病属于神经衰退类疾病,对老年人生活质量的影响不容忽视。由于神经衰退疾病发病机制复杂,涉及到的一些错误折叠蛋白无法被深入研究,导致目前帕金森病病因仍不明确,尚没有根治办法。

 

在错误折叠蛋白中,一个不能忽视的蛋白就是 α 突触核蛋白。近些年来有关该蛋白的研究不在少数,但是由于α突触核蛋白的多样性和复杂性,科研学者们很难确定到底是蛋白折叠的哪个环节出现了问题。

α突触核蛋白总的来说分为可溶性单体、寡聚体以及不溶性原纤维,目前的共识是寡聚体是所有 α 突触核蛋白类型中毒性最高的,而且可能是导致蛋白聚集和病理现象扩散的关键。

 

但是由于α突触核蛋白寡聚体大小各异,处于动态平衡状态,很容易聚集形成聚集体或分离成单体,所以目前很难分离出高纯度的寡聚体。虽然目前全球有一些实验室分离出了少量的α突触核蛋白寡聚体,但是却没有达到可以量产并能够提供给其他学者来分析其结构功能的程度。

 

StressMarq 今年全新推出动态学稳定(kinetically stable/trapped)的 α 突触核蛋白寡聚体(SPR-484),该α突触核蛋白寡聚体不含任何诱导剂或抑制剂,可用于活性电泳(native PAGE)、体内体外检测以及疾病建模。由于不含任何诱导剂或抑制剂(多巴胺、茶多酚 EGCG 等),科研学者们可以更直接地研究其结构及其在细胞和活体中的反应,不需要担心其他成分的影响。

 

● StressMarq 实验室 SPR-484 的产品数据,见图1~图4


 Stressmarq新产品---α 突触核蛋白寡聚体

图 1. 动态学稳定的 α 突触核蛋白寡聚体(SPR-484)和 α 突触核蛋白原纤维(SPR-322)电镜图

注:A 为 SPR-484 电镜图;B 为 SPR-322 电镜图。负染色透射电子显微镜图像在 80 Kv 下使用磷钨酸和醋酸铀染色,在碳涂层的 400 目铜网格上获得。

 

 由图1   可以清晰地看到, SPR-484 α突触核蛋白寡聚体呈现圆球 / 短圆柱形状,并且具有很高的均匀性,而 α 突触核蛋白原纤维(SPR-322)则为长条纤维状。SPR-484 α突触核蛋白寡聚体没有使用任何诱导剂或抑制剂来锁定寡聚体状态,并且寡聚体含量能达到 90%。

Stressmarq新产品---α 突触核蛋白寡聚体

图 2. SPR-484 的活性电泳和尺寸排阻色谱(SEC) 

注:A 为冻融一次后的动态学稳定寡聚体的活性电泳。

60 kDa 处出现条带是因为 SPR-484 中含有少量单体,α 突触核蛋白单体是一个内在无序的 14 kDa 的蛋白,由于它在溶液中的伸展结构,游离的 α 突触核蛋白单体在活性电泳和 SEC 中的迁移和球状的 60 kDa 寡聚体类似。而大于 250 kDa 的条带是动态学稳定的 α 突触核蛋白寡聚体。B 和 C 分别是冻融一次后和 37℃ 孵育两周后的 SPR-484 尺寸排阻色谱(SEC)。

 

 由图2  可以看出,即使是在冻融和 37℃ 处理 14 天后,在峰值区域大概仍有 90% 的 SPR-484α突触核蛋白寡聚体稳定于寡聚体状态。

Stressmarq新产品---α 突触核蛋白寡聚体 

图 3. SPR-484 对多巴胺能神经元毒性检测

注:A为经寡聚体处理后 11 天,大鼠原代多巴胺能神经元的存活率由抗 MAP2 抗体量化(对照组设定为 100%);B 为经寡聚体处理后 11 天,大鼠原代多巴胺能神经元中存在的 α 突触核蛋白 pSer129 水平可通过抗 α-突触核蛋白 pSer129 抗体与抗 MAP2 抗体的比率量化(对照组设定为 100%)。

 

 由图3  可以看出,SPR-484 α突触核蛋白寡聚体对多巴胺能神经元有毒性并且可以诱发帕金森病理现象(pSer129)。所有数据经过统计学验证,而非偶然性结果。

 Stressmarq新产品---α 突触核蛋白寡聚体

图 4. SPR-484 处理的大鼠原代多巴胺能神经元(IHC)

注:A 为用对照 PBS 缓冲液处理后 11 天的大鼠原代多巴胺能神经元,B 为用 10 µg/mL SPR-484 处理后 11 天的大鼠原代多巴胺能神经元。

细胞核染色蓝色(Hoechst),多巴胺能神经元显示红色(MAP2),病理现象为绿色(α-syn pSer129)。两个培养基都使用鸡抗-MAP-2 多克隆抗体,小鼠抗-αsyn pSer129-特异的单克隆抗体,Alexa Fluor 488 羊抗小鼠 IgG,Alexa Fluor 647 羊抗鸡 IgG,和荧光标记物 Hoechst 溶于相同的溶液。白色箭头指的是 pSer129 病理现象较强的区域,比例尺代表 100 μm。

注:SPR-484 为 E.coli 表达的,并且蛋白在加入神经元之前没有磷酸化。

 

 由图4  可以看出,动态学稳定的SPR-484α突触核蛋白寡聚体和原纤维一样可以诱发病理现象。

 

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