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细胞检测(CELL CULTURE)

2021-11-22
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细胞检测

以下步骤是使用被活性和对照alpha突触核蛋白前体纤维原(PFFs)处理的神经元获取ICC图片的实验指南。活性alpha突触核蛋白PFFs处理的原代大鼠海马体神经元显示了路易体的内含形成,而经对照alpha突触核蛋白处理的神经元没有出现路易体形成。


1.海马体神经元取自出生一天的Sprague Dawley大鼠幼鼠,然后接种在PDL和层粘连蛋白包被的孔板上,每孔80,000个细胞。

2.前体纤维原在水浴超声波仪中处理1小时,然后马上进行神经元处理。

3.神经元用 4 µg/mL 的前体纤维原处理。对照孔中只有转移媒介不含alpha突触核蛋白。

4.所有板孔7天后经过一个 50% 基液变化。

5.基液变化7天之后(离体处理14天后),所有板孔用4%甲醛固定20分钟。

6.用过滤过的10 mM PBS洗掉甲醛,洗三次 (每次10分钟)。

7.用1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (LiCOR, 927-40010) 和 30 mL/mL 的0.1% triton-X 100 固定细胞 30 分钟。

8.30分钟之后, 用 1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (含 30 mL/mL 的 0.1% triton-X 100) 稀释一抗,并加入到板孔中,4℃下过夜孵育。

9.第二天, 用过滤过的10 mM PBS洗掉一抗溶液 ,洗三次 (每次10分钟)。

10.用 1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (含 30 mL/mL 的 0.1% triton-X 100) 稀释二抗,然后加入到板孔里黑暗中孵育60分钟。

11.60分钟过后, 用过滤过的10 mM PBS洗掉二抗溶液 ,洗三次 (每次10分钟).

12.用落射荧光显微镜 (Olympus IX73, B&B 显微镜) 20X 目镜观察孔板拍照.

13.所有图片都是在相同的比例和曝光时间下拍取的.


一抗: 抗-pSer129

复染色: Hoechst reagent

复染色稀释度: 1:3000

复染色孵育时间: 1 hr


细胞检测(CELL CULTURE)

细胞检测(CELL CULTURE)

原代大鼠海马体神经元被1型突触核蛋白前体原纤维(SPR-322) 4 µg/ml (D-F) 处理后显示路易体内含物的形成,而当被2型突触核蛋白前体原纤维(SPR-317) 4 µg/ml (A-C)处理时没有路易体内含物形成. 组织: 原代海马体神经元. 物种: 斯普拉-道来氏大鼠. 固定: 由PFA制作的4% 甲醛. 一抗: 小鼠抗pSer129 抗体, 稀释度 1:1000, 4°C下处理24 小时. 二抗: FITC 羊抗小鼠 (绿色) 稀释度 1:700室温下孵育1小时. 复染色: Hoechst (蓝色) 细胞核染色, 1:4000 室温下孵育1小时. 细胞定位: 路易体内含物. 放大倍数: 20x.原代大鼠海马体神经元 (DIV16) 被1型小鼠α-突触核蛋白前体原纤维(SPR-324) 4 µg/ml (D-F) 处理后显示路易体内含物的形成以及细胞减少,而当被对照突触核蛋白前体原纤维(A-C)处理时没有路易体内含物形成及细胞减少. 组织: 原代海马体神经元. 物种: 斯普拉-道来氏大鼠. 固定: 由PFA制作的3% 甲醛固定20分钟. 阻断: 1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (LiCOR, 927-40010) 以及 30 mL/mL, 0.1% triton-X 100 阻断 30 分钟. 一抗: 小鼠抗pSer129 抗体 (1:1000), 以及兔抗pSer129 (1:800), 4°C下处理24 小时. 二抗: ATTO 546 驴抗小鼠 (1:700) 和 ATTO 488 驴抗兔 (1:700) 室温下孵育一小时 (复合图绿色). 复染色: Hoechst (蓝色) 细胞核染色, 1:3000 室温下孵育1小时. 细胞定位: 路易体内含物. 放大倍数: 20x.


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