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酶联免疫吸附实验(ELISA)实验方法

2021-11-17
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酶联免疫测定是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合,发展建立一种非放射性标记免疫分析方法。由于ELISA具有灵敏度高、特异性强,酶免疫试剂的性质比较稳定,操作方法简便快速、无放射性污染以及应用范围广等很多优点,在医学基础理论研究,病毒学和生物化学检验等工作中应用十分广泛。


该法需将纯化的抗原包被在固相载体,与一定稀释度的待侧血清反应,然后与酶标记的第二抗体(抗人IgG,IgA,IgM或抗人IgG.A.M的混合物)反应,酶可催化色原反应,在酶标测定仪一定波长下进行比色,测定吸光度。


ELISA试剂盒的关键是要具备高质量纯化或重组的抗原,对生产厂家的抗原要求很高。由于纯化的或重组的抗原越来越多,以及商品化的高质量的ELISA试剂盒的面市,它应用于临床免疫实验室的自身抗体的检测已日渐增多,该法检测自身抗体快速、敏感及特异性高。

一、免疫荧光法----自身抗体诊断的标准技术(IFA)


免疫荧光测定法可分为直接和间接两类,在自身抗体检测中,以间接免疫荧光法最为常用。由于自身抗原的位置决定了其相应的抗体的典型荧光模式,该法能通过显微镜观测精确地判断组织或细胞内荧光的分布。


将已稀释血清与实验基质进行温育,令特异性抗体与实验基质中相应抗原结合,然后再与荧光标记的第二抗体温育,最后在荧光显微镜下观察相应部位的特异性荧光模式。


此方法敏感、重复性好。但需要一台质量较好的荧光显微镜,且对操作人员要较高,操作复杂耗时长,繁琐。


二、免疫印迹法(Immunoblot assay)(westerblot)


此法是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白及多肽与免疫反应的高特异性相结合的一项技术。蛋白质在电泳中依分子量大小分离,然后将分离好的蛋白转印到硝酸纤维薄膜上,用酶标记的抗体或蛋白A进行染色。该法简单、快速。是目前美国、中国等国际上众多国家卫生机构的最终确认方法。但其制备方法繁琐、成本相对较高。


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