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触发天然免疫和自噬的线粒体DNA

2021-05-17
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线粒体是独特的哺乳动物细胞器,以细胞的能量工厂著称,普遍认为是由需氧菌进化而成。线粒体在细胞代谢和细胞凋亡中扮演重要角色。越来越多的研究表明,线粒体在天然免疫中有核心作用,并可能促成炎症疾病。在感染和应激之后,受损的线粒体释放其组分,包括线粒体 DNA(mtDNA),后者是一种强效的损伤相关分子模式(DAMP),可通过多种模式识别受体(PRRs)诱导炎症反应。参与识别mtDNA的主要几种PRRs是:Toll-like receptor 9 (TLR9),Nod-likereceptor family,pyrin domain containing 3 (NLRP3)和 cyclic GMP-AMP (cGAMP) synthase (cGAS)。


线粒体DNA类似于细菌DNA,因其包含非甲基化CpG二核苷酸重复序列,后者可被小胞体受体TLR9识别。一些研究表明,由于受损而释放在胞浆循环中的mtDNA可直接活化TLR9,从而活化NF-kB,产生促炎性因子如TNF-a和IL-61-3。用TLR9抑制性ODNs1,2或敲除Tlr9基因4,被证实可削弱炎症反应,因此证实TLR9参与mtDNA的识别。


另外一个炎症通路,是mtDNA引发形成NLRP3炎症小体。最近发表的数据提示,释放在胞浆中的mtDNA可活化NLRP3炎症小体,导致caspase-1依赖的促炎性细胞因子IL-1b和IL-18的分泌。去除mtDNA可有效抑制IL-1b和IL-18的分泌,即使细胞被炎症小体诱导剂刺激5。此外,氧化的mtDNA被证实可直接结合并活化NLRP36。


线粒体DNA也可活化cGAS-STING启动产生1型干扰素(IFNs)而触发炎性反应。最近的文献表明,在细胞凋亡过程中释放到胞浆的mtDNA可活化cGAS,产生cGAMP,后者招募STING,下游进一步活化TBK1-IRF3信号通路,产生1型干扰素7,8。另有最新研究表明,疱疹病毒感染引起细胞应激而产生的mtDNA也可活化cGAS-STING信号通路9。


mtDNA触发的炎症反应与自噬密切相关。自噬是一种关键的适应机制,多余的胞浆成份(如DNA,蛋白,线粒体和细胞内病原)被双膜泡 (自噬体)“没收”,后者与溶酶体融合,降解其中捕获的胞浆组分,达到清除效果,从而保护细胞避免应激诱导的损伤。另外,自噬可通过调节如NF-kB10和STING11等关键免疫调控器来限制过激的炎症反应。在如微生物感染和重大创伤的病理状态下,功能失调的线粒体和受损mtDNA在胞浆中积累至超出自噬降解能力时,自噬的负向调节功能随之丧失。结果导致炎症反应大幅提升,常伴有慢性炎症的发生,后者由于TLR92,12,NLRP35和(或)cGAS-STING13应答异常而引起。mtDNA在线粒体相关疾病,包括感染疾病,自身免疫病和癌症中的作用机制,还有待于更进一步的研究来解析。


1. Zhang Q. et al., 2010. Circulating mitochondrial DAMPs cause inflammatory responses to injury. Nature. 464(7285):104-7.

2. Oka T. et al., 2012. Mitochondrial DNA that escapes from autophagy causes inflammation and heart failure. Nature. 485(7397):251-5.
3. Garcia-Martinez I. et al., 2016. Hepatocyte mitochondrial DNA drives nonalcoholic steatohepatitis by activation of TLR9. J Clin Invest. 126(3):859-64.

4. Wei X. et al., 2015. Cationic nanocarriers induce cell necrosis through impairment of Na(+)/K(+)-ATPase and cause subsequent inflammatory response. Cell Res. 25(2):237-53.

5. Nakahira K. et al., 2011. Autophagy proteins regulate innate immune responses by inhibiting the release of mitochondrial DNA mediated by the NALP3 inflammasome. Nat Immunol. 12(3):222-30.

6. Shimada K. et al., 2012. Oxidized mitochondrial DNA activates the NLRP3 inflammasome during apoptosis. Immunity. 36(3):401-14.

7. White MJ. et al., 2014. Apoptotic caspases suppress mtDNA-induced STINGmediated type I IFN production. Cell. 159(7):1549-62.
8. Rongvaux A. et al., 2014. Apoptotic caspases prevent the induction of type I interferons by mitochondrial DNA. Cell. 159(7):1563-77.

9. West AP. et al., 2015. Mitochondrial DNA stress primes the antiviral innate immune response. Nature. 520(7548):553-7.

10. Zhong Z. et al., 2016. NF-κB Restricts Inflammasome Activation via Elimination of Damaged Mitochondria. Cell. 164(5):896-910.

11. Saitoh T. et al., 2009. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. PNAS;106(49):20842-6.

12. De Leo MG. et al, 2016. Autophagosome-lysosome fusion triggers a lysosomal response mediated by TLR9 and controlled by OCRL. Nat Cell Biol. 18(8):839-50.

13. Lan YY. et al, 2014. Dnase2a deficiency uncovers lysosomal clearance of damaged nuclear DNA via autophagy. Cell Rep. 9(1):180-92.



自噬报告基因细胞

自噬通过溶酶体将包浆物质降解,是维持恒定程序的基本要素。这一多步骤程序包括将物质分离入泡膜,形成自噬体,与溶酶体融合,降解和再循环内容物。研究自噬潮(autophagic flux)的关键蛋白是LC3(微管相关蛋白1轻链3)。在分离膜形成时,胞浆中的LC3被招募并进入自噬程序,此定位动作被视为自噬膜的特征,用以检测自噬的生成和发展。由LC3B融合一个绿色银光蛋白(GFP)和一个红色荧光蛋白(RFP)组成的嵌合蛋白,是检测自噬进程的简单方法。自噬体形成可被RFP-GFP-LC3标记,显示RFP和GFP双信号。与溶酶体融合后,酸性环境可显著降低GFP信号,RFP信号却保持稳定。


HeLa-DiFluo™ hLC3 Cells
RAW-DiFluo™ mLC3 Cells
THP1-DiFluo™ hLC3 Cells

 

自噬报告基因细胞HeLa-Difluo™hLC3细胞,RAW-Difluo™mLC3细胞和THP1-Difluo™hLC3细胞分别源于人上皮瘤细胞系HeLa,鼠源巨噬细胞系RAW264.7和人源单核细胞系THP-1。这些报告基因细胞全部稳定表达RFP::GFP::LC3融合蛋白(RFP-GFP-LC3):人源或鼠源LC3的N末端融合两个荧光报告蛋白,RFP(酸性稳定)和GFP(酸性敏感)。在这些报告基因细胞中,通过荧光显微镜检测绿色GFP-LC3和(或)红色RFP-LC3斑点的呈现状态,实现RFP-GFP搭配实时检测自噬潮的功能。在自噬早期,RFP和GFP信号皆可被探知,当进入自噬体与溶酶体融合程序,GFP荧光信号消失,只留下可视的RFP荧光信号。GFP-LC3/RFP-LC3阳性细胞和RFP-LC3阳性细胞的比例可用来评估自噬潮的阶段,这一方法已被报道1,2。


HeLa-Difluo™ hLC3 cells,RAW-Difluo™ mLC3 cells和THP1-Difluo™ hLC3 cells对Zeocin™有抗性。


1. Loos B. et al. 2014. Defining and measuring autophagosome flux- concept and reality. Autophagy. 2014;10(11):2087-96.

2. Kimura S. et al., 2007. Dissection of the autophagosome maturation process by a novel reporter protein, tandem fluorescent tagged LC

3. Autophagy. 3(5):452-60.


HeLa-Difluo™hLC3细胞被25μM rapamycin 单独处理或25μM rapamycin和 500nM bafilomycin A1(抑制自噬体和溶酶体融合)联合处理。孵育24小时,用2% PFA固定细胞,并用共聚焦显微镜分析结果。请注意在图片viii中,黄色(自噬体)和红色(自噬溶酶体)斑点均显著提升,而图片ix中的斑点几乎均为黄色(自噬体)。


自噬诱导剂和抑制剂

自噬是原生分解程序,由细胞内应激物(营养物和能量贫乏)引起。自噬由生成自噬体开始,这一步骤由一系列蛋白调控,包括VPS34的III型磷脂酰肌醇(PI)3激酶复合体,随后与溶酶体的融合将自噬体酸化。自噬的阻断有多种方式,例如III型PI3激酶抑制剂可通过抑制自噬捕获动作而阻断自噬进程,或者用抑制溶酶体酸化的抑制剂阻止自噬溶酶体的形成和自噬降解。自噬进程是被缜密调控的。mTORC1,一种对营养物和生长因子敏感的激酶,是自噬的主要阻遏器。因此,mTORC1及其信号通路的抑制剂可诱导产生自噬。


原代细胞培养的抗菌剂

Primocin™

原代细胞培养,始终要面对来源于原代器官(如,皮肤或肠道样本)或周遭环境中(如实验室,仪器,实验人员等)微生物毁灭性污染的威胁。为了保护您的原代细胞免受污染,InvivoGen开发出一种独家专利广谱抗生素,Primocin™。


产品描述
Primocin™通过阻断微生物DNA和蛋白合成从而去除支原体,细菌和真菌。Primocin™的作用靶点仅存在于微生物中,包括三个细菌靶点(DNA旋转酶,原核生物核糖体亚单位30S和50S)和一个真菌靶点(麦角固醇,一种仅在真菌和酵母细胞膜发现的分子)。由于特殊的“鸡尾酒”抗生素设计,Primocin™对于某些广泛存在于实验室的细菌(如Pseudomonas aeruginosa,Listeria monocytogenes和Bacillus species)甚至比InvivoGen自主研发的Normocin™处理效果更好。更为重要的是,Primocin™对原代细胞无细胞毒性,这要归功于其抗真菌剂成分与Amphotericin B比,无毒性且更加稳定。


应用及功效
Primocin™在原代细胞分离,培养的文献中高频引用。例如,在外周血单核细胞(PBMCs)中分离原代人源自然杀伤(NK)细胞的亚克隆1;从鼠胚胎脑组织中分离星形胶质细胞和神经元细胞2。另外,最近的研究证明Primocin™处理干细胞污染的功效,如脆性X综合症中人源胚胎干细胞的神经诱导3。在Wang et al.等设计的长期培养人源多能干细胞(hPSCs)方案中,使用Primocin™配合InvivoGen抗支原体制剂Plasmocin™来预防细菌和支原体污染,被视为成功分选和培养的“关键步骤”4。有些科研团队将Primocin™应用于先端生物学领域:3D细胞培养和生物人工脏器。例如,Graham et al. 在研究鼠源生物人工结肠中研究内质网应激(ER stress)而产生炎症和凋亡过程,将Primocin™加入鼠源生物人工结肠培养基,以预防污染5。 类似的研究还有,Weeber和同事用Primocin™确保从结肠直肠癌(CRC)分离的转移活检癌类器官可以正常增殖6。Nichols et al.在从原代成年人肺细胞和儿童肺支架建立肺类器官时两次使用Primocin™:处理肺源组织,以及培样分离的肺器官和气管、支气管细胞7。
虽然Primocin™与其它抗生素完美兼容,但其最大的优点是使用Primocin™时,无需添加其它抗生素。在原代细胞培养中,Primocin™可以处理其它抗生素无法杀死的微生物,消除威胁,无疑是您的最佳选择。例如,最近Cao & Poss在关于斑马鱼心脏外植体培养的文章中指出,Primocin™可降低最初几天心外膜细胞污染的几率,然而青霉素/链霉素(Pen/Strep)和 Fungizone™(Amphotericin B)的组合并不能避免污染8。
Primocin™也可用于保护无限增殖化细胞系。比如,Pastrana et al.用Primocin™处理293TT,ART,SFT和A549,以确保随后BK多瘤病毒的感染筛选实验不受干扰9。
全世界的研究者都信赖Primocin™保护原代细胞不受支原体,细菌和真菌入侵的功效。也请同时关注InvivoGen其它广谱抗菌剂(请查看相关产品)。

 

1. Garcia-Beltran et al., 2016. Open conformers of HLA-F are high-affinity ligands of the activating NK-cell receptor KIR3DS1, Nat. Immunol., 17:1067–1074.

2. Grabner GF. et al., 2016. Deletion of Monoglyceride Lipase in Astrocytes Attenuates Lipopolysaccharide-induced Neuroinflammation. J Biol Chem., 291(2):913-23.

3. Telias M. et al., 2015. Functional Deficiencies in Fragile X Neurons Derived from Human Embryonic Stem Cells. J. Neurosci.. 35(46):15295-306.

4. Wang et al., 2016. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression, Nat. Prot., 11(2):327-346.

5. Graham et al., 2016. MEM258 Is a Component of the Oligosaccharyltransferase Complex Controlling ER Stress and Intestinal Inflammation, Cell Rep., 11(13):2955–2965.

6. Weeber et al., 2015. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases, PNAS, 112(43):13308-11.

7. Nichols et al., 2016. Giving new life to old lungs: methods to produce and assess whole human paediatric bioengineered lungs, J. Tiss. Eng. Reg., [Ahead of print].

8. Cao & Poss, 2016. Explant culture of adult zebrafish hearts for epicardial regeneration studies, Nat. Prot., 11:872–881.

9. Pastrana et al., 2013. BK Polyomavirus Genotypes Represent Distinct Serotypes with Distinct Entry Tropism, J Virol. 87(18):10105–10113. 


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