细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症反应。Annexin V是一种Ca²⁺依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如（PI）有拒抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为Annexin V ^-/PI^-；右上象限是凋亡晚期细胞或凋亡继发性坏死细胞，为Annexin V ⁺/PI⁺；而右下象限为早期凋亡细胞，显现Annexin V ⁺/PI^-（图1）。

图1 细胞凋亡的Annexin V-FITC/PI检测法

试剂准备
结合缓冲液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl₂
Annexin V-FITC溶液

碘化丙锭（PI）溶液

实验步骤
1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，500~1000r/min离心5min，弃去培养液。
2. 用预冷，4℃无菌的PBS充分洗涤细胞两次，用250μ结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×10⁶/ml。
3. 取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V-FITC和10μl 20μg/ml的PI溶液，混匀后室温下避光孵育10~15min。
4. 孵育后加入400ul结合缓冲液，立即上流式细胞仪分析。（实验必须在一小时内完成）
5. 流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的带通滤器（band pass filter)检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。

注意：另外需制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：

1. 未染色的细胞；

2. 仅用Annexin V-FITC染色的细胞；

3. 仅用PI染色的细胞。

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