酶联免疫斑点（enzyme-linked immunosorbent spot, ELISpot）检测技术是通过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况的一种方法。

淋巴细胞在体内被抗原激活后，或者在体外培养中被培养液中含有的特异性抗原货刺激剂激活后，将这些细胞转入ELISpot培养板中。这些活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子，在孵育的过程中可在分泌细胞原位被ELISpot培养板上包被的特异性细胞因子抗体所捕获。将细胞和过量的细胞因子洗除后，加入生物素标记的检测抗体，孵育后洗去多余检测抗体。然后加入酶标记的链亲和素（二抗），孵育后洗去多余酶标链亲和素（二抗）。最后加入酶的底物，作用后可形成不溶的颜色产物即斑点（Spot）。每个斑点是激活的淋巴细胞分泌的细胞因子区域，代表一个活性淋巴细胞。实验结果可在显微镜下观察或使用酶联免疫斑点自动图像分析仪（如BioReader 4000 Pro-X）来进行计数分析（图1）。该方法可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力及记数特异性抗原刺激下分泌淋巴细胞产生的情况。与ELISA方法相比，ELISpot灵敏度高102~103倍。ELISpot不仅能分析细胞因子分泌的总量变化，更能独特检测活化淋巴细胞的数量变化，广泛应用于病毒感染、疫苗活性检测、肿瘤治疗、自身免疫等领域。

图1 ELISpot技术原理

一、试剂的准备

含5%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基；无菌PSB（pH7.4）,PBST（含0.05%Tween-20的无菌PBS）；PBS-BSA（含1%BSA的无菌PBS）；含ConA(4~8ug/ml)或PHA（1.25~10ug/mk）的培养液；70%乙醇或35%乙醇；Millipore公司ELISpot专用培养板。

二、ELISpot标准步骤

第一天：ELISpot包被（需无菌操作）
用乙醇预湿PVDF膜、无菌去离子水洗涤去除乙醇、拍干，最后，加入已稀释好的包被抗体到各实验孔完成包被操作。

1.每孔加入15μL 70%的乙醇（ELIIP plates，millipore）或35%的乙醇（MSIP plates，millipore），预湿1min。
注意：
（1）未润湿PVDF膜是洁白、不透明的；经乙醇润湿后，颜色变暗，呈半透明状，很容易观察二者的区别。
（2）加乙醇时，枪头应该靠在孔壁接近孔底的地方，注意枪头不要刺到PVDF膜。
（3）若加入的乙醇挂在孔壁上，盖上板盖，轻轻叩击，让乙醇顺势滑落。乙醇一旦接触到PVDF膜，就会在表面张力和毛细作用之下迅速浸润整块膜，使得膜的颜色和透明度发生变化。
（4）15μL是经过优化的体积，能保证刚好完全浸润整块膜，而不会有剩余。请勿随意加大用量！
（5）膜在润湿后如果不做处理，大约10min后由于乙醇的挥发会重新变干。所以应该在膜变干之前加入去离子水，两步的时间间隔不要超过5min。否则，膜需要重新润湿。
2.洗涤：200μL/孔加入去离子水，洗涤3-5次。洗涤目的在于：除去预湿用的乙醇。因此应该尽量洗涤干净，减少残留。
3.包被：按说明书操作。加入稀释好的包被抗体，4°C包被过夜。
4.封闭：（次日）倾倒包被液，用无菌1×PBS洗涤3-5次。最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。200μL/孔加入封闭液，37°C封闭1h。
5.倾倒封闭液，无须洗涤，直接加入检测细胞进行ELISPOT检测。

第二天：接种细胞,加入刺激物，培养（需无菌操作）

整个实验设置1组正对照（PHA刺激），每一个细胞样品（同一个捐献者或实验动物）要设1组负对照（不加刺激物），整块板还要加1组背景负对照（不含细胞，只加培养基和所有检测试剂）。每一个细胞/刺激物的组合设复孔（建议2-4孔，可根据实验要求自行调整复孔数目）。

1.取出封闭好的板，按照实验安排，接种不同浓度的细胞，100μL/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀。
（1）正对照：细胞浓度为1×104 cells/well。
（2）细胞样品：样品细胞浓度请实验者自行摸索调整，通常为1～5×105cells/well。
（3）背景负对照：加入100μL的培养基，该孔即为背景负对照孔。
2.每孔加入相应的刺激物，盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37°C培养12-48h。培养的过程中，不要移动或震动（包括开关培养箱门）培养板，否则会导致细胞在培养板上的移动，从而得到不规则斑点或者斑点花纹，影响最终结果。
    注意：在使用ConA、PHA等阳性刺激物时， 一般加入的淋巴细胞数为（0.1~2）×105。在使用抗原作为刺激剂的情况下，每孔细胞浓度可在（1~4）×105。在使用多克隆抗体刺激剂的情况下，应适当调低细胞浓度。但由于所用刺激剂的强度和批号不同，建议初次进行ELISpot检测时，对刺激剂浓度和细胞浓度设立梯度，以保证较理想的实验结果。

 第三天：检测（不需要无菌操作）

1.裂解细胞：倾倒孔内的细胞及培养基，200μL/孔加入冰冷的去离子水，4°C冰浴10min（低渗法裂解细胞）。
2.洗涤：每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干。
3.加入检测抗体：每孔加入100μL稀释好的生物素标记检测抗体，37°C孵育1h。
4.洗涤：每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干。
5.加入酶标亲和素：每孔加入100μL稀释好的酶标亲和素，37°C 1小时。
6.洗涤：每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗涤液，重复5次。最后一次可以用PBS，避免Tween 20对显色剂的影响，在吸水纸上扣干。
7.显色：每孔加入100μL的显色液，室温孵育15-45min（在20 -25°C，显色25min较合适），注意避光。至显微镜下可以观察到斑点为止。
8.去除显色液，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，室温静置10-30min，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。
9.在倒置显微镜下观察结果或使用自动酶联斑点图像分析仪进行分析。

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