植物基因组DNA的提取通常采用机械研磨的方法,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并可减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide,简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,简称SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,即得植物总DNA溶液。
一.CTAB法 CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中((0.7 mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白,多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
1.试剂准备 (1)2×CTAB抽提缓冲溶液: 100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0),20 mmol/L EDTA-Na2,1.4mol/LNaCl,2% CTAB,使用前加入0.1%(V/V)的β-巯基乙醇。 (2)TE 缓冲液:10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA( pH8.0)。 (3)DNase-free RNase A: 溶解RNase A 于TE 缓冲液中,浓度为10mg/mL,煮沸10~ 30min, 除去DNase 活性,-20℃贮存。 (4)氯仿-异戊醇混合液(24:1,V/V):240mL 氯仿(A.R.)加10mL 异戊醇(A.R.)混匀。 (5)3mol/L 乙酸钠(NaAc,pH6.8):称取NaAc•3H2O 81.62g,用蒸馏水溶解,配制成200mL,用HAc 调pH 至6.5。
2.实验步骤 (1)在2mL离心管中,加入500μl的2×CTAB和20 μl β-巯基乙醇, 65℃预热。 (2)称取新鲜叶片1-2g,用蒸馏水冲洗干净,再用无菌ddH2O冲洗2次,放入经液氮预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉末状,用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中,总体积达到1mL混匀后置65℃水浴中保温45-60min,并不时轻轻转动试管。 注:冻存材料直接研磨,绝对不能化冻。而且粉末应在化冻前转移否则内源性Dnase有可能降解基因组DNA。 (3)加入1/10体积的3mol/L的乙酸钠充分混匀,在冰浴中放置30 min中,4°C 12000 rpm离心5 min,吸上清。 注意,对于幼嫩叶片此步可以省略。对成熟的老叶片需采用。 (4)加等体积的氯仿/异戊醇(24:1),轻轻地颠倒混匀,室温下12 000rpm离心10 min。 (5)移上清至另一新管中,用氯仿/异戊醇重复抽提一次。 (6)移上清至另一新管中,向管中加入1/10体积的RNase A溶液,置37℃ 20-30min。 (7)氯仿/异戊醇抽提后,加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇,会出现絮状沉淀,-20℃放置30 min,12 000rpm离心10-15min回收DNA沉淀。 (8)用70%乙醇清洗沉淀两次,吹干后溶于适量的灭菌TE缓冲液中。 (9)0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。用紫外分光光度计测定DNA浓度。
二.SDS法 SDS法的基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后,加入高浓度的KAc,0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质,最后用乙醇或异丙醇沉淀。
1.试剂准备 (1)提取缓冲液 Tris-HCl 100mmol/L(pH8.0) EDTA 50mmol/L (pH8.0) NaCl 500 mmol/L 灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L (2)裂解液20%SDS (3)高盐溶液5mol/L KAc (4)RNaseA 10mg/ml
2.实验步骤 (1)取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净,再用灭菌ddH2O冲洗2次,放入经液氮预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉末状,用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。 (2)向管中加入50μL 20%SDS溶液,混匀,不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 ,65℃保温10min,并不时摇动。 (3)加入150μL 5mol/L KAc,混匀,置冰上20-30 min。 (4)4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中,加入0.7倍体积的异丙醇,混匀,-20℃沉淀30 min 。 (5)12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀,吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。 (6)加入1/10体积的RNaseA,37℃保温20min,除去RNA。 (7)氯仿抽提后,加2倍体积乙醇,-20℃沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。 (8)用400μL 70%乙醇洗两次后,吹干,加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。 (9)琼脂糖凝胶电泳检测完整性。用紫外分光光度计测定DNA浓度。
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