胶体金是一种常用的标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。

1971年Faulk 和Taytor将胶体金引人免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法( immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链ＤＮＡ抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。

（一）基本原理

免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl₄）在还原剂如柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。

胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

（二）胶体金的制备

胶体金的制备一般采用还原法，根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下：

1．枸橼酸三钠还原法

（1）10nm胶体金粒的制备：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液3ml，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色。

（2）15nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加入1％枸橼酸三钠水溶液2ml，加热煮沸15min～30min，直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K₂CO₃0.5ml，混匀即可。

（3）15nm、18nm～20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备：取0.01％HAuCl₄水溶液100ml，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18～20nm、30nm和50nm。

金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶，见表1。

表1  100 ml 氯金酸中柠檬酸三钠的加入量对金溶胶粒径的影响

2．鞣酸-枸橼酸钠还原法

用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶

A液：1％HAuCl₄水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。

B液：1％枸橼酸三钠4ml，1％鞣酸0.7ml，0.1Mol/L K₂CO₃液0.2ml，混合，加入双馏水至20ml。

将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5nm。如需要制备其它直径的金颗粒，则按表2所列的数字调整鞣酸及K₂CO₃的用量。

表2鞣酸-枸橼酸钠还原法试剂配制表

3．白磷还原法
在120ml双蒸馏水中加入1.5ml１％氯金酸和1.4ml 0.1mol/L K2CO3，然后加入 1ml五分之一饱和度的白磷乙醚溶液，混匀后室温放置15分钟，在回流下煮沸直至红褐色转变为红色。此法制得的胶体金直径约 6nm，并有很好的均匀度，但白磷和乙醚均易燃易爆，一般实验室不宜采用。

要得到大小更均匀的胶体金颗粒，可采用甘油或蔗糖密度梯度离心，经分级后制得胶体金颗粒直径的变异系数（ＣＶ）可小于１５％。

4．制备高质量胶体金的注意事项

（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒。

（2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜（0.45µm）过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。

（3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。

（4）氯金酸的质量要求上乘，杂质少。最好是进口的。

（5）氯金酸配成1％水溶液在4℃可保持数月稳定，由于氯金酸易潮解，因此在配制时，最好将整个小包装一次性溶解。

（三）免疫胶体金的制备 

胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。

1．待标记蛋白溶液的制备 

由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000g4℃离心1h，去除聚合物。

2．待标胶体金溶液的准备 

以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至9.0；标记McAb时,调至8.2；标记亲和层析抗体时，调至7.6；标记SPA时，调至5.9～6.2；标记ConA时，调至8.0；标记亲和素时，调至9～10（表2）。

由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。

表3   常用几种蛋白质标记时胶体金的 PH

3．胶体金与标记蛋白用量之比的确定

（1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。

（2）将标记蛋白（以IgG为例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5µg/ml～50µg/ml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。

（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。

（4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％～20％。

4．胶体金与蛋白质（IgG）的结合 

将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液终浓度为1％；1％聚乙二醇加至总溶液的1／10。

5．胶体金标记蛋白的纯化

（1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。

用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心（20nm金胶粒用1 200r/min，5nm金胶粒用1 800r/min）20min，弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g，4℃离心1h；20nm～40nm胶体金结合物，14 000g，4℃离心1h。仔细吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB液（含0.02％NaN3），将沉淀重悬为原体积的1／10，4℃保存。如在结合物内加50％甘油可贮存于-18℃保存一年以上。

为了得到颗粒均一的免疫金试剂，可将上述初步纯化的结合物再进一步用10％～30％蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。

（2）凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。将胶体金蛋白结合物装入透析袋，在硅胶中脱水浓缩至原体积的1／5～1／10。再经1 500r/min离心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝胶S-400）层析柱分别纯化。层析柱为0.8 cm×20cm，加样量为床体积的1／10，以0.02Mol/L PBS液洗脱（内含0.1％BSA，0.05％NaN3，pH8.2者用IgG标记物），流速为8ml/h。按红色深浅分管收集洗脱液。一般先滤出的液体为微黄色，有时略混浊，内含大颗粒聚合物等杂质。继之为纯化的胶体金蛋白结合物，随浓度的增加而红色逐渐加深，清亮透明，最后洗脱出略带黄色的为标记的蛋白组分。将纯化的胶体金蛋白结合物过滤除菌、分装,4℃保存。最终可得到70％～80％的产量。

6．胶体金蛋白结合物的质量鉴定

（1）胶体金颗粒平均直径的测量：用支持膜的镍网（铜网也可）蘸取金标蛋白试剂，自然干燥后直接在透射电镜下观察。或用醋酸铀复染后观察。计算100个金颗粒的平均直径。

（2）胶体金溶液的OD520nm值测定：胶体金颗粒在波长510nm～550nm之间出现最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1％BSA，0.02％NaN3）将胶体金蛋白试剂作1︰20稀释，OD520＝0.25左右。一般应用液的OD520应为0.2～0.4。

（3）金标记蛋白的特异性与敏感性测定：采用微孔滤膜免疫金银染色法（MF－IGSSA）。将可溶性抗原（或抗体）吸附于载体上（滤纸、硝酸纤维膜、微孔滤膜），用胶体金标记的抗体（或抗原）以直接或间接染色法并经银显影来检测相应的抗原或抗体，对金标记蛋白的特异性和敏感性进行鉴定。

7. 胶体金的稳定性及免疫胶体金的贮存

胶体金具有很高的动力学稳定性，在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢，可放置数年不发生凝聚。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。

金溶胶必须有少量电解质作稳定剂，但浓度不宜过高。高浓度亲水性非电解质能剥去胶粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物质促使溶胶凝聚，但一定量的高分子物质反而可增加溶胶稳定性，如蛋白质、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的稳定效果。

当金溶胶吸附蛋白质后，溶胶的稳定性随溶液pH而变化，而这种变化又取决于吸附蛋白质的等电点，如ConA，过氧化物酶等，当pH较低时保持稳定，提高pH则显得不稳定，接近等电点或略高时又变得稳定了。标记后的胶体金溶液可用0.2～0.5mg/ml PEG20000 作为稳定剂。在4～10℃贮存数月有效，不宜冰冻。贮存中可能会发生程度不同的凝聚，可离心除去。

（四）胶体金标记技术在免疫学中的应用 

胶体金标记技术由于标记物的制备简便，方法敏感、特异，不需要使用放射性同位素，或有潜在致癌物质的酶显色底物，也不要荧光显微镜，它的应用范围广，除应用于光镜或电镜的免疫组化法外，更广泛地应用于各种液相免疫测定和固相免疫分析以及流式细胞术等。

1.液相免疫测定

将胶体金与抗体结合，建立微量凝集试验检测相应的抗原，如间接血凝一样，用肉眼可直接观察到凝集颗粒。利用免疫学反应时金颗粒凝聚导致颜色减退的原理，建立均相溶胶颗粒免疫测定法（Sol particle immunoassay ,SPIA）已成功地应用于PCG的检测，直接应用分光光度计进行定量分析。

2.胶体金在电镜水平的应用
　　胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。直径为3～15nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。3～15nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径15nm 多用于检测量较多的感染细胞。
　　胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。②单层培养中细胞内抗原的检测。③组织抗原的检测。
　　金标记在电镜水平的应用，主要方法包括：包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、双标记技术和原位杂交技术等。
　　实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和诊断。

3.胶体金在光镜水平的应用
　　胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。各种细胞涂片、切片均可应用。主要用于：①用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。②检测培养的单层细胞胞内抗原，③组织中或亚薄切片中抗原的检测。

胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点。

4.金标记流式细胞术

应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记困难，因此必须寻找一种非荧光素标记物，用于流式细胞计数。这样可以同时进行几种标记。胶体金可以明显改变红色激光的散射角，利用胶体金标记的羊抗鼠Ig抗体应用于流式细胞术，分析不同类型细胞的表面抗原，结果胶体金标记的细胞在波长632nm时，90度散射角可放大10倍以上，同时不影响细胞活性。而且与荧光素共同标记，彼此互不干扰。

5.免疫印迹技术(immunoblotting)

免疫胶体金也可用于该法的定量。转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体保温后，再与经葡萄球菌Ａ蛋白致敏的胶体金温育，彻底洗去多余的胶体金，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。
    利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性，更可大大提高测定灵敏度，检测下限可低至 0.1ng，这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。

6.免疫层析快速诊断技术中的应用
　　免疫层析法(immunochromatography)是一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

7.胶体金固相免疫测定法

（1）斑点免疫金银染色法（Dot－IGS／IGSS）是将斑点ELISA与免疫胶体金结合起来的一种方法。将蛋白质抗原直接点样在硝酸纤维膜上，与特异性抗体反应后，再滴加胶体金标记的第二抗体，结果在抗原抗体反应处发生金颗粒聚集，形成肉眼可见的红色斑点，此称为斑点免疫金染色法（Dot－IGS）。此反应可通过银显影液增强，即斑点金银染色法（Dot－IGS／IGSS）。

（2）斑点金免疫渗滤测定法（dot immuno-gold filtration assay,DIGFA）此法原理完全同斑点免疫金染色法，只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料，即为渗滤装置。在加抗原（抗体）后，迅速加抗体（抗原），再加金标记第二抗体，由于有渗滤装置，反应很快，在数分钟内即可显出颜色反应。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白的检测。